锐谈 | ACS Catal: D-氨基酸氨基转移酶的定向进化产生（R）-β-转氨酶

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发布时间：2023-05-16 15:02
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吡哆醛-5′-磷酸（PLP）依赖性转氨酶（TAs）根据对不同的氨基供体大致分为α-或ω-TA，ω-TAs可进一步分为两个亚组，即β-TAs和胺转氨酶（ATAs）。ATAs 可以将氨基从胺化合物（不是来自 β 和 γ-氨基酸）可逆地转移到氨基受体上，相反，β-TA可以可逆地将氨基从β和γ-氨基酸和胺转移到氨基受体上。

研究者将（R）-β-TA活性引入来自vanbaalenii分枝杆菌的（R）-β-ATA之后，突变体显示出广泛的底物特异性和对芳香胺的高活性。但是这可能会改变了酶的立体选择性。选择来自Bacillus subtilis的D-氨基酸转氨酶（DATA）做为支架，将（R）-β-TA活性引入DATA，所得突变体（HW1）对β-和γ-氨基酸（分别为54和10mU/mg）表现出相当大的催化活性。进一步对HW1进行迭代饱和诱变（ISM）的进化，采用邻二甲苯二胺（OXD）的高通量筛选方法，也就是携带突变文库的大肠杆菌转化体在含有IPTG和OXD的LB琼脂平板上生长。以苯甲醛作为氨基受体，进化得到的Mab和Mba比初始HW1的酶活分别高173和129倍。

使用突变体（R）-β-TA（Mab/Mba）进行全细胞催化来拆分2 mM外消旋β、γ-和δ-氨基酸底物，均成功分离成相应的（S）-构型（ee >99%），转化率约为50%，对映选择性高（E > 100）。

进一利用突变体（Mab/Mba），以40mM（R）-PEA（氨基供体）和10 mM相应的酮酸不对称合成相应的β、γ-和δ-氨基酸时，可合成7.6 mM（R）-γ-氨基酸，它的催化性能与天然存在的（S）-β-TAs相当，最高可得到5.1 mM的（R）-β-氨基酸（ee值>99%）以及2.88mM相应的（R）-δ-氨基酸。